Son dos los métodos originales ideados por Camilo Golgi:
– Método Lento: consiste en la inmersión del bloque de tejido en a): una solución de bicromato de potasio al 3%, que luego se aumenta hasta el 5 %, durante un tiempo que oscila entre 4 a 6 semanas y b) impregnación con nitrato de plata a una concentración que puede ser al 0,5 o al 1 %, durante 24 horas.
– Método Rápido: Aquí la solución usada es de bicromato de potasio al 2,5 % combinado con ácido ósmico al 1% (1 a 7 días).
Partiendo de estos métodos se ha diversificado la técnica presentándose variantes o subvariantes del método original, de manera que el nombre del método de Golgi se utiliza de un modo genérico para designar a un amplio grupo de técnicas en las que se lleva a cabo una fijación con sales dicrómicas (o crómicas-dicrómicas), que pueden ir acompañadas de otros fijadores, bien sea de manera simultánea, anterior o posterior a la cromación. Cromación que es seguida por la exposición a sales metálicas, fundamentalmente argénticas (nitrato de plata), también se usa sales plúmbicas, ejemplo cloruro de plomo, de mercurio. Aunque no se sabe el mecanismo exacto de esta reacción, se indica que las sales originadas forman un precipitado de microcristales que se depositan de manera característica en todos aquellos espacios extracelulares ,así como también en espacios intracelulares limitados por membranas ejm aparato de Golgi, envoltura nuclear.
A excepción del aparato empleado en la realización de cortes de los tejidos, para llevar a cabo ésta técnica, no se requiere de un instrumental muy costoso ni de un desarrollo técnico complejo, pero el método ha sido reconocido como inconstante, aleatorio, a veces irreproducible, de allí que dada su importancia, cada laboratorio halla buscado la forma de ensayar a fín de lograr una variante que se adapte mejor a sus requerimientos. Esta es la razón por la que no existe un procedimiento único, sino un desarrollo general ampliado y mejorado por numerosas adaptaciones. De este modo la técnica y sus posibilidades son multiplicadas por modificaciones que buscan mejorar los resultados en distintas regiones encefálicas, en especies diferentes o en distintos estadios de desarrollo. Muchas de éstas variantes no son reconocidas por la mayoría de los investigadores, de manera que no existe una relación ordenada de los resultados obtenidos que se ofrecen con todas las posibilidades del método de Golgi. En manos avezadas, algunos de estas técnicas son capaces de dar sin duda datos de significado revolucionario Como complemento hay que señalar que la utilidad del método de Golgi se puede potenciar considerablemente, cuando se combina con otras técnicas, ejemplo: marcaje con trazadores (peroxidasa de rábano) o con sustancias fluorescentes, histoquímicas, inmunohistoquímicas, microscopia electrónica; todos estos métodos combinados son más delicados de usar.
En este curso ensayaremos con variantes de este método, encontrando en la literatura revisada que, entre las más rápidas y económicas que se han divulgado se incluyen las variantes del método de Golgi-cromato acidificado, específicamente las ideadas por E. Palacios Prü (1976)
Las formulas originales no llevaban glutaraldehido.
Estas variantes presentan cierta selectividad, indicándose que con las variantes mas bajas
( 33- 60 – 44), se obtiene preferencialmente impregnaciones de células pequeñas, lo contrario ocurre con las otras variantes
La cromación llamada también fijación preimpregnadora o mordiente tiene por finalidad preparar al tejido para la posterior impregnación metálica. El bicromato de potasio o de sodio se considera un fijador muy oxidante de alto coeficiente de penetración que estabiliza los lípidos complejos sin precipitar las proteínas, estableciendo puntos de unión con las proteinas, haciéndo además insoluble a un número de lípidos insaturados; a pesar de lo precitado se indica que por si solo el dicromato no es un buen fijador, pués torna el tejido muy frágil, de allí que se usa unido a otros fijadores.
La inmersión en este líquido indurante puede realizarse una sola vez (cromación simple) o varias veces, utilizando la misma fórmula o combinación de ellas, hablándose entonces de cromaciones dobles, triples, etc.
Después de impregnación se continúa con la impregnación en bloque usando nitrato de plata
PROTOCOLO
1- Fijación: (Prefijación). La cual puede hacerse por perfusión intravascular central (corazón), durante 15 a 20 minutos. Esta fijación intravascular termina sustituyendo la sangre estabilizando rápidamente el tejido, por ejemplo la masa encefálica. Para detalles del modus operandi ver detalles generales sobre fijación.
2- A veces obviamos el paso precedente y la fijación se hace tan solo por inmersión con el liquido fijador (sustancia cromante), de cualesquiera de las variantes citadas en el cuadro n° 1 El tiempo de cromación oscila entre 18 a 24 horas.
Debemos tener la precaución de combinar los ingredientes de la sustancia cromante justo antes de usarla y guardarla en la oscuridad.
3- Tras la cromación se realiza un breve lavado en agua destilada
4- Impregnación con nitrato de plata al 1.5% , en nuestro caso durante 18 a
24 horas.
5. Tres lavados breves en agua destilada.
6. Inmersión en alcohol isopropílico al 70%..Este paso representa el inicio de la
posterior deshidratación
7. Corte: Consiste en la rebanación del bloque de tejido a un grosor determinado. Aquí prescindimos de la inclusión antes de cortar el bloque de tejido, en cambio realizamos el encastramiento y después cortamos en un vibratomo de deslizamiento.
Grosor de los cortes: de todas las técnicas histológicas conocidas es esta la que se realiza en cortes mas gruesos
El grosor de los cortes va a depender fundamentalmente de la densidad de la impregnación. Si las células marcadas son numerosas, conviene hacer cortes relativamente finos (entre 50 y 75 micras), para así poderlas estudiar individualizadas, por el contrario si tenemos un numero reducido de células muy bien impregnadas, debemos realizar cortes entre 200 y 300 micras, lo que nos permite seguir en las tres dimensiones, sus prolongaciones axónicas y dendríticas sin necesidad de reconstruirlas a través de numerosas secciones. En condiciones normales donde se impregne un numero intermedio de células se puede cortar entre 100 y 150 micras.
La recogida de los cortes se hace con alcohol isopropílico al 70%, auxiliándonos para ello con pinceles de cerdas suaves.
8. Deshidratación .La deshidratación se comienza en baños de alcohol etílico
de graduación creciente: 70% y 80%, seguidos de dos baños de alcohol
96% y dos baños de alcohol etílico absoluto. Cada baño es de 5 a 10
minutos.
Los alcoholes absolutos proporcionan una mejor transparencia a las secciones. Es necesario que estén completamente deshidratados, de otro modo se forma un precipitado de fondo blanco lechoso durante la diafanización o aclaramiento, que pronto estropea el preparado.
9. Diafanización o aclaramiento, consiste en el paso por xilol: dos baños de 10 minutos cada uno.
10. Montaje: Se puede hacer con distintas resinas hidrófobas sintéticas tales como: Entellan, Eukitt, DPX, Permount (suelen ser algo ácidas lo que puede provocar un deterioro en las neuronas)
El medio de montaje más usual y clásico es el bálsamo de Canadá, siendo neutro y se puede llegar a realizarse sin utilizar cubreobjetos.
11. Observación al microscopio
PRERREQUISITOS PARA LA REALIZACIÓN
DEL MÉTODO CROMOARGÉNTICO
A) Equipo Indispensable:
Balanza
Agitador
Balines imantados
Probetas, matraces, pipetas (3 con perilla) Cápsula de Petri
Campana para anestesia (para la inhalación de eter)
B) Reactivos Indispensable: Agua destilada en cantidad suficiente
Formol o Paraformaldehido (preferiblemente)
Dicromato de sodio o de potasio
Nitrato de plata
Preparación de buffer
Estos reactivos más el equipo precitado, nos permite tener preparado con antelación las siguientes sustancias:
Para formaldehído al 4% (PB), si se va hacer la perfusión
Sustancia cromante es decir dicromato de potasio o de sodio al 2.5%
Nitrato de plata al 1.5%
INMERSIÓN EN SUSTANCIA MORDIENTE Y POSTERIOR IMPREGNACIÓN
DESHIDRATACIÓN Y ACLARAMIENTO
F)
a) Alcohol isopropílico, en concentraciones crecientes 70%, 80%, 96%
b) Alcohol etílico
c) Xilol
d) Cronómetro
MONTAJE
G)
a) Portaobjetos
b) Cubre objetos
c) Medio de montaje
OBSERVACIÓN
H)
a) Microscopio
APORTE MUY PERSONALIZADO
1- Entusiasmo
2- Dedicación
3- Paciencia
SESIÓN VII
Técnicas especiales
Técnica del ácido peryódico de Schiff (técnica de pas)
Prof. Belkys Chacín de Rincòn
La técnica del Ácido Periódico de Schiff (PAS), es una de las técnicas histoquímicas. Es de amplia aplicación en el diagnóstico histopatológico rutinario. Puede colorear numerosos componentes bioquímicos (hidratos de carbono o sustancias relacionadas con ellas).
No es una coloración, su principio se basa en una serie de reacciones químicas entre el tejido y los reactivos usados.
Fue descubierta por Hotchkiss, McManus y Lilie.
El reactivo de Pas, consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryódico para incrementar el número de grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presente en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente por el reactivo de Schiff. El ácido periódico es un oxidante selectivo, ya que oxida algunas sustancia químicas. Así podemos deducir que a través de este oxidante, el tejido es preparado por medio de una oxidación, la cual actúa sobre los azúcares que lo contienen y los convierten en aldehídos, es cuando actuaría el reactivo de Schiff.
El reactivo de Schiff, se conoció en el año 1886, como una recoloración de la fucsina básica, la cual es tratada con ácido sulfuroso, que hace desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula, trasformándose en una sustancia incolora (ácido sulfofucsínico o reactivo de Schiff).
Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos flanqueados por los correspondientes radicales OH, aparece de nuevo el doble enlace (grupo cromófobo) y, con él, la coloración rojo fucsia característica.
Compuestos PAS positivos:
Polisacáridos simples
Mucopolisacáridos neutros
Mucoproteínas
Glucoproteínas del suero, membrana basal y fibras de reticulina
Glucolípidos
Pigmentos ceroide y ciertas lipofucsinas
Coloraciones de contraste:
Hematoxilina
Amarillo de Mars
Azul de Toluidina
Picrocarmin de índigo
Verde de metilo
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE SCHIFF
Fucsina Básica 1 gr
Agua Destilada 200 ml
Metabisulfito de Sodio o Potasio 2 grs
Ácido Clorhídrico 1 N, 10 ml
Carbón Activo 0.5 – 1 gr
PROCEDIMIENTO DE LA PREPARACIÓN
Calentar la fucsina básica a punto de ebullición
Enfriar hasta 40-50 ºC aproximadamente
Filtrar
Agregar el metabisulfito
Ácido Clorhídrico 1 N
Se guarda por 24 horas en envase ámbar (oscuro)
A las 24 horas se agrega el carbón activo
Agitar y filtrar (se repetirá la filtración hasta transparentar)
Guardar en la nevera en frasco ámbar
PROTOCOLO DE LA TÉCNICA
DEL ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF
1. Desparafinar e hidratar (estufa, baños de xilol y alcohol 95%)
2. Lavar en agua corriente
3. Lavado en agua destilada
4. Ácido peryódico al 0.5% por 15 minutos
5. Lavado en agua corriente por 5 minutos
6. Lavado en agua destilada
7. Reactivo de Schiff por 10 a 15 minutos (lo da el tejido cuando esté rosado)
8. Lavar en agua corriente por 5 minutos
9. Lavar en agua destilada
10. Hematoxilina de 3 a 5 minutos
11. Lavar en agua corriente durante 5 minutos
12. Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS:
Glucógeno, mucinas y algunas membranas basales de rojo a púrpura.
Núcleos azules.SESIÓN VIII
Técnicas especiales
Coloraciones tricrómicas
Prof. Elizabeth Ramírez de Zambrano
Son todas las técnicas para la tinción de fibras de colágeno, las cuales en los tejidos presentan la propiedad de dar una coloración diferente de la del colorante empleado en la rutina.
Las fibras de colágeno son componentes de los tejidos conectivos, éstos últimos son tejidos bastantes pleomorfos caracterizados por poseer diferentes tipos de fibras y células contenidas en una sustancia fundamental.
Hay tejidos conectivos propiamente dichos que lo encontramos en todo el organismo, formando parte de los órganos (cápsula estroma), vasos, ligamentos, tendones, aponeurosis, etc; con función de sostén, transporte, protección y tejidos conectivos especializados en su función, como la sangre, el tejido óseo, cartílago y adiposo.
El tejido conectivo está compuesto por:
1- Células: A) fijas (fibroblastos, fibrocitos, mesenquimáticas, adipocitos, miofibroblastos).
B) libres (macrófagos, mastocitos, linfocitos, plasmocitos, polimorfonucleares y monocitos)
2- Matriz extracelular, que contiene: A) fibras: colágenas (varios tipos), elásticas,
reticulares, fibronectina, entanctina, etc. B) sustancia fundamental: agua, electrolitos, glucosaminoglicanos, proteoglucanos.
Las coloraciones tricrómicas, son tinciones especiales que permiten visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I, que son proteínas fibrilares que forman las fibras gruesas o haces, que están diseñados para dar resistencia; en menor intensidad las fibras reticulares. En el tejido conectivo denso colágeno predominan éstas fibras sobre las demás fibras, presentándose como trayectos ondulantes de color rosado con la coloración de Hematoxilina-eosina.
Método tricrómico: fue inventado por Mallory en 1900, para colorear el tejido conectivo con azul de metileno. Su formula contenía, además orange G, ácido oxálico, fucsina ácida y ácido fosfomolíbdico.
El método de Mallory, fue modificado por Masson en 1912, el cual utiliza es azul de anilina. No usa ácido oxálico. Mallory usa ácido fosfomolíbdico, mientras que Masson usa ácido fosfotúngstico.
La acción de estos ácidos es diferenciar la coloración, es decir respetar el teñido de determinadas partes del preparado (en éste caso la fucsina ácida se fija sobre algunos elementos y el colágeno es decolorado). También tienen acción mordiente, es decir actúan como vinculo entre el tejido y el colorante acrecentado la unión específica entre ambos.
El fundamento de estas tinciones depende de varios factores, como son:
1- Permeabilidad: el colágeno y los otros elementos acidófilos del tejido tienen distintos grados de permeabilidad al paso del colorante, que depende fundamentalmente de su grado de dispersión en la disolución empleada, siendo importante el tamaño de la molécula y la agregación iónica del colorante en la solución.
De acuerdo a la interacción del colorante en la estructura, se genera un gradiente de penetración distinto para cada grupo de colorantes, responsable de la diferente coloración de cada estructura; por ello los colorantes utilizados para las diferentes tinciones tricrómicas se clasifican en:
Colorantes nucleares: laca de hematoxilina férrica
Colorantes citoplasmáticos: ácido pícrico, naranja G, naranja de metilo, ponceau de xilidina, escarlata Biebrich, azofloxina.
Colorantes del conectivo: derivados del anillo trifenilmetano: fucsina ácida, azul de anilina, verde luz SF.
2- Afinidad: Debido a los grupos catiónicos presentes en las estructuras (colágeno, reticulina) que depende de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica; por ello estas fibras tienen afinidad por los colorantes ácidos que están cargados negativamente.
3- Valor del pH a que se utiliza los colorantes: tienen mejor apetencia por las fibras colágenas en medio fuertemente ácido (específicamente a un pH optimo en torno al 1.5), mientras que un pH de 2.5 su afinidad por los aniones decrecen hasta el 50%, de forma que con este pH se obtiene una coloración difusa e incompleta del estroma finamente fibrilar.
4- Fenómenos de mordiente: Los ácidos bloquean selectivamente los residuos básicos existentes en el tejido a excepción de los muy fuertemente catiónicos del colágeno, donde luego se acoplarán los radicales aniónicos de los derivados del trifenilmetano (colorantes del colágeno); es decir estas sustancias actúan como un vínculo entre el tejido y el colorante acrecentando la unión específica entre ambos. Existen numerosos mordientes de distinta naturaleza, entre los más importante: Ácidos: fosfotúngstico, molíbdico, crómico, pícrico. Sales: sublimado de oro, sulfato aluminico potásico. Otros: tetróxido de osmio, permanganato potásico.
Tipos de métodos tricrómicos:
Mallory
Masson
Van Gieson
Gomori
Rojo sirio
Se considera la coloración de Van Gieson la más selectiva de las fibras colágenas; sin embargo la de Gomori y Masson son consideradas confiables por la reproducibilidad de sus resultados y la simplicidad operativo.
Para el procedimiento técnico debe tenerse en cuenta la fijación del tejido ya que dependiendo del método a utilizar varían los fijadores; por ejemplo para el de Mallory el fijador debe contener dicromato, para el de Masson y Gomori es de elección el Bouin, Van Gieson cualquier fijador.
COLORACIÓN DE VAN GIESON
PROCEDIMIENTO TÉCNICO:
FIJACIÓN: cualquier fijador es válido
SOLUCIONES:
a) Hematoxilina férrica de Weigert:
Solución 1: – Hematoxilina cristalizada ……………………. 1 g
– Etanol al 95% …………………………… 100 ml
Solución 2: – Cloruro férrico anhidro (FeCl3 o …………….. 1.5 g
– FeCl3 6H2O ………………………………….. 2.48 g
– Agua destilada ………………………………100 ml
Solución de trabajo:
-Mezclar a partes iguales la solución 1 y 2. En este momento la solución se
torna de color negro-azulado que rápidamente vira a pardo-negruzco.
– Preparar en fresco y añadir:
* Ácido clorhídrico concentrado ………………………….. 1 ml
b) Picro-fucsina de Van Gieson:
Solución 1: – Fucsina ácida ………………………………… 1g
– Agua destilada ………………………………100 ml
Solución 2: Solución acuosa saturada de ácido pícrico:
– Ácido pícrico ………………….. 2 g
– Agua destilada ……………… 100 ml
Solución de trabajo:
Solución 1 …………………………………………………. 10 ml
Solución 2 …………………………………………………. 90 ml
Se debe dejar madurar durante algunas semanas o si está recién preparada, se le
agrega inmediatamente antes de su uso 0.25 ml de ácido clorhídrico concentrado
OPERACIÓN:
1- Desparafina e hidratar: – Colocar las láminas en la estufa a 60º por 3-4 minutos.
– Xilol: 3 baños, 2 minutos c/u.
– Alcohol 95%: 3 baños, 2 minutos c/u.
2- Colorear los núcleos con hematoxilina férrica de Weigert durante 10 minutos.
3- Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
4- Aclarar en agua destilada.
5- Teñir en la solución de trabajo de Van Gieson durante 30 segundos a 1 minuto.
6- Secar con papel de filtro.
7- Lavar rápidamente en etanol al 70%.
8- Completar la deshidratación con rapidez; aclarar:
Alcohol 95%: 3 enjuague
Alcohol – xilol: 1 enjuague
Xilol: 2 enjuague
9- Montar
RESULTADOS:
Núcleos: azul – negruzco
Citoplasmas: amarillo
Colágeno: rojo intenso
SESIÓN IX
Fundamentos de microscopía
Observación e interpretación de los preparados histológicos
Prof. Daniel Narváez Armas
El microscopio es un instrumento que permite ver y estudiar estructuras, que por cuyo tamaño no podemos observarlas a simple vista. Aporta una imagen considerablemente aumentada de las mismas. Ese resultado es obtenido gracias a la combinación de varias lentes que constituyen la porción óptica, las cuales son mantenidas y sostenidas por un conjunto de piezas que corresponden a la porción mecánica.
El microscopio de mayor uso en el laboratorio es denominado Compuesto, formado por un sistema de lentes. Posee una montura, un sistema de iluminación, lentes objetivas y oculares. Algunos microscopios poseen accesorios que permiten realizar mediciones, dibujos, etc.
Lentes.
Son instrumentos ópticos que producen la Convergencia o Divergencia de los rayos luminosos. Están hechas a partir de vidrio y poseen dos superficies, aplanadas o curvas, de allí que se pueden denominar biconvexas, plano-convexas, etc.
Las lentes de superficie convexa se denominan positivas, convergentes, recolectoras o de aumento.
Las lentes de superficie cóncava se denominan negativas, divergentes, dispersantes y producen una imagen reducida.
Refracción.
Las propiedades de las lentes se deben a los fenómenos de refracción que sufren los rayos luminosos que las atraviesan. Cuando un rayo incide perpendicularmente a la superficie de una lámina de vidrio de caras paralelas, no es desviado de su trayecto rectilíneo cuando pasa por el vidrio y sale al aire nuevamente (a).
Si el rayo incide oblicuamente sobre el vidrio, es desviado de su dirección rectilínea; primero, a su entrada al vidrio (en el momento del paso de un medio menos denso, el aire, a otro más denso, el vidrio) y segundo, luego de su salida del vidrio al aire (b).
Esta desviación se denomina Refracción. La nueva dirección que toma el rayo refractado depende de la densidad del medio atravesado.
Las lentes convexas son las únicas que nos interesan y la refracción en ellas se produce según las mismas leyes. El estudio somero de esos fenómenos es indispensable para comprender las propiedades de las lentes.
Formación de la imagen en las lentes convexas:
Los fenómenos de refracción que ya conocemos van a permitirnos explicar como las lentes pueden formar las imágenes.
Dos leyes resultan de tales consideraciones:
1.- Todo rayo que pasa por el centro de la lente NO es refractado.
2.-Todo rayo que no pasa por el centro de la lente ES refractado.
Los rayos refractados convergen TODOS en un punto que se denomina FOCO o Punto Focal de la lente.
Distancia Focal: es la distancia que separa el FOCO del centro de la lente.
Tomemos una lente biconvexa y un objeto. La imagen de ese objeto va a variar dependiendo de si está alejado o cercano a la lente. Tres casos se pueden presentar:
1.-El objeto está muy alejado de la lente, a una distancia mayor que la distancia focal. La imagen será real e invertida y cada vez más pequeña si el objeto está más alejado. Es el caso de los objetivos fotográficos.
2.-El objeto está colocado un poco más allá del foco. La imagen será real e invertida y cada vez más grande si el objeto se acerca más al foco. Es el caso de los objetivos del microscopio.
3.-El objeto se encuentra entre el foco y la lente. La imagen será virtual y derecha. Será cada vez más pequeña mientras más cerca esté el objeto de la lente. Es el caso de las lupas y del ocular del microscopio.
Imagen Real: Será formada por rayos convergentes y puede ser recogida sobre una pantalla o un aplaca fotográfica.
Imagen Virtual: Se forma por rayos divergentes, al contrario de la imagen real. Es una imagen puramente subjetiva que no puede ser proyectada sobre una pantalla o placa fotográfica. La percibimos porque nuestro ojo sigue la prolongación de esos rayos divergentes que se proyectan detrás del objeto, de tal manera que se constituya la imagen virtual. Esta imagen juega un rol primordial en los instrumentos ópticos
Formación de la imagen en el microscopio compuesto:
Lo que sabemos de las lentes y sus propiedades va a permitirnos comprender el principio del microscopio compuesto, el cual obtiene su denominación porque está formado por dos sistemas de lentes, los cuales están centrados y tienen el mismo eje óptico.
La lente próxima al objeto se llama objetivo y posee una distancia focal muy corta. Es fácil colocar el objeto mas allá del foco para así obtener una imagen real, invertida y aumentada.
El lente por el cual observamos se denomina ocular. Funciona como una lupa y sirve para observar y aumentar la imagen real suministrada por el objetivo.
La distancia entre el ocular y el objetivo debe calcularse de tal manera que la imagen real producida por el objetivo se forme por dentro del foco de la lente ocular.
La lente objetivo produce una imagen REAL, INVERTIDA y AUMENTADA. Que se forma por dentro de foco de la lente ocular.
El ojo del observador percibirá en consecuencia, a través del ocular, una imagen VIRTUAL, DERECHA y AUMENTADA de la imagen real.
El microscopio está compuesto de una parte óptica y una parte mecánica
Parte óptica: Consiste de tres sistemas de lentes: el condensador, los objetivo y el ocular.
– El condensador está ubicado debajo de la platina coincidiendo con su orificio central. Está constituido por un sistema de lentes convergentes que colecta y proyecta los rayos de luz hacia la fina sección del objeto estudiado. Un diafragma, similar al que regula las lentes de la cámara fotográfica, controla la cantidad de luz que pasa a través de él. El papel del condensador es usualmente subestimado por que no contribuye en el aumento de la imagen, pero influye en su nitidez y en la riqueza de sus detalles.
– Los objetivos son las lentes más próximas al objeto que se examina, son lentes pequeñas, plano-convexas montadas en el revólver o portaobjetivo; tiene por función producir una imagen aumentada, real e invertida. Existen diversos tipos de objetivos: objetivos ordinarios en seco, son aquellos que tienen la lente superior separada de la preparación por aire; y objetivos de inmersión, que se diferencian de los anteriores porque entre la lente frontal y la preparación, se interpone un líquido transparente con índice de refracción superior al del aire. El líquido mas utilizado es el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es casi igual al del vidrio (cubreobjeto) de la preparación. Sin embargo, usualmente, se utilizan los objetivos secos: lupa (2.5x y 3.5x), bajo poder (10x), alto poder seco (40x) e inmersión (100x).
– El ocular es la lente por la cual se mira y que está próxima al ojo. Es un tubo corto que lleva a ambos extremos una lente o un sistema de lentes convergentes y un diafragma fijo e intermedio donde se ubica el señalador, a ese nivel se forma la imagen definitiva. Produce un aumento adicional y logra la imagen final que es aumentada, virtual y derecha de la obtenida por el objetivo.
Parte mecánica: Está constituida por una serie de piezas que conforman el microscopio y le brinda soporte a la parte óptica.
– La fuente de luz es esencial para el microscopio fotónico. La luz de la lámpara pasa a través del condensador o es reflejada por el espejo al condensador, el espécimen, el lente objetivo y el ocular.
– El tornillo macrométrico es un botón lateral de gran diámetro, activa un sistema de movimientos rápidos, que se utilizan para buscar un punto aproximado al del enfoque.
– El tornillo micrométrico es un botón lateral de pequeño diámetro, activa un sistema de movimientos lentos que se utilizan para obtener un enfoque exacto.
– La platina es una placa metálica, horizontal, donde con ayuda de unas pinzas, se fijan las preparaciones histológicas. Las platinas tienen una perforación central por donde pasan los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación, situado por debajo de ella. Algunas platinas están provistas de dos vernier, dispuestos en forma tal que permite el desplazamiento lateral y anteroposterior del preparado.
– El revólver o portaobjetivo es una pieza que mediante un movimiento giratorio permite utilizar sucesivamente varios objetivos de diversa amplificación.
– El tubo tiene por finalidad sostener el ocular y el revólver en sus extremos superior o inferior, respectivamente.
– La columna es la parte mecánica que sostiene las piezas anteriormente descritas.
– El pie es la base que asegura la estabilidad del microscopio.
La calidad de la imagen depende del poder resolutivo del microscopio. El aumento es independiente de su poder resolutivo. Dicho poder resolutivo depende principalmente de sus objetivos; el ocular solo aumenta la imagen obtenida por el objetivo pero no aumenta el poder de resolución. El aumento total del microscopio es igual al aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular.
El microscopio óptico posee poca capacidad para diferenciar objetos con índice de refracción semejante, motivo por el cual los elementos a estudiar deben ser contrastados con el uso de colorantes.
IMÁGENES DIGITALES:
Son fotos electrónicas tomadas con una cámara digital o escaneadas de documentos –fotografías o ilustraciones. Se realiza una muestra de la imagen digital y se confecciona un mapa de ella en forma de cuadrícula de puntos o elementos de la figura (píxeles). A cada píxel se le asigna un valor tonal (negro, blanco, matices de gris o color), el cual está representado en un código binario (ceros y unos). Los dígitos binarios ("bits") para cada píxel son almacenados por una computadora en una secuencia. Luego la computadora interpreta y lee los bits, produce una versión analógica para su visualización o impresión.
La RESOLUCIÓN es la capacidad de distinguir los detalles finos. La frecuencia espacial a la cual se realiza la muestra de una imagen digital (la frecuencia de muestreo) es un buen indicador de la resolución. Este es el motivo por el cual dots-per-inch (puntos por pulgada) (dpi) o pixels-per-inch (píxeles por pulgada) (ppi) son términos sinónimos utilizados para expresar la resolución de imágenes digitales.
Las DIMENSIONES DE PÍXEL son las medidas horizontales y verticales de una imagen, expresadas en píxeles. Las dimensiones de píxel se pueden determinar multiplicando tanto el ancho como la altura por el dpi.
La COMPRESIÓN se utiliza para reducir el tamaño del archivo de imagen para su almacenamiento, procesamiento y transmisión. El tamaño del archivo para las imágenes digitales puede ser muy grande, complicando las capacidades informáticas y de redes de muchos sistemas.
Los FORMATOS DE ARCHIVO consisten tanto en los bits que comprende la imagen como en la información del encabezamiento acerca de cómo leer e interpretar el archivo. Los formatos de archivo varían en términos de resolución, profundidad de bits, capacidades de color, y soporte para compresión y otros datos. El formato estándar es el Bit-mapped graphics format, usado en plataforma Windows, termina con la extensión .bmp.
Tabla: Formatos de archivo de imágenes más recomendados:
EL CONTROL DE CALIDAD es un componente esencial de la digitalización de imágenes, y tiene como fin asegurar que se han cumplido las expectativas en cuanto a calidad. El mismo abarca procedimientos y técnicas para verificar la calidad, precisión y consistencia de los productos digitales. Las estrategias de control de calidad pueden ser implementadas en diferentes niveles:
Selección del objetivo del microscopio que nos permitirá obtener el aumento adecuado del preparado.
Selección del campo a fotografiar en el preparado histológico.
Enfoque correcto de la estructura.
Captura de la imagen, tomando en cuenta los parámetros y corrección de variables como enfoque, iluminación, control de color, brillo y contraste.
LA GESTIÓN DE ARCHIVOS consiste en una serie de pasos interrelacionados, diseñados para asegurar la fácil identificación, organización, acceso y mantenimiento de los archivos. Dado que hay fuertes conexiones entre los diversos aspectos de la gestión de archivos, planifique con antelación para evitar tomar decisiones que limiten las opciones posteriormente.
Los pasos de la gestión de archivos que se tratan aquí incluyen:
Bases de datos de imágenes y otras soluciones de gestión de imágenes (software especial para organizar archivos de imágenes);
Almacenamiento (dispositivos y medios);
Mantenimiento (copias de seguridad -backup-, transporte, preservación y seguridad) (Preservación digital).
Siga algunas recomendaciones básicas acerca de los sistemas de archivos:
Utilice un sistema de asignación de nombres que sea compatible con cualquier sistema operativo y medio de almacenamiento que planee utilizar;
Utilice extensiones de archivo estándar para los distintos tipos de archivos (jpeg, gif…)
No sobrecargue los directorios con demasiados archivos.
PRESERVACIÓN DIGITAL
El objetivo de la preservación digital es mantener la capacidad de visualizar, recuperar y utilizar colecciones digitales. Los asuntos que se deben tratar en la preservación digital incluyen el mantener la fiabilidad física de los archivos de imagen, por ejemplo, asegurarse de que el medio de almacenamiento es confiable, con copias de seguridad (back-up en discos compactos, 3 ½, unidades zip…), mantener la infraestructura de hardware y software necesaria para almacenar y proporcionar acceso a la colección.
Consideraciones de la computadora:
Las bases de datos están diseñadas para funcionar en sistemas de escritorio bajo MacOS o Windows. Sin embargo, incluso una colección pequeña puede verse sobrecargada en un sistema. La mayoría de las aplicaciones de bases de datos deben funcionar en Windows NT/2000, XP, que se ejecutan en máquinas con procesadores rápidos, mucha memoria RAM, puertos USB (buses) rápidos de entrada / salida y periféricos, y rápidos dispositivos de almacenamiento.
Para la captura de imágenes microscópicas es necesario:
Microscopio trinocular con diferentes objetivos, conectado a un regulador de voltaje.
Cámara (analógica o digital) conectada al microscopio, ya sea a través del adaptador para microscopio trinocular (con tubo vídeo/foto y adaptador C-mount). También es posible en algunas cámaras, conectar directamente el objetivo de la cámara a uno de los oculares del microscopio.
Computador con la configuración adecuada.
Las cámaras analógicas CCD han sido las más utilizadas. La calidad de las imágenes obtenidas en estos casos estará en relación con la resolución y calidad no sólo de la cámara, sino también de la tarjeta digitalizadora. Las principales desventajas de las cámaras analógicas son la escasa resolución (con una resolución máxima de 640 x 400 píxeles). La principal ventaja de las cámaras analógicas es la posibilidad de grabar secuencias de vídeo de hasta 30 cuadros por segundo. En estos sistemas analógicos la resolución obtenida es pobre y se observa la mala calidad de la luz obtenida a bajos aumentos.
Las cámaras digitales ofrecen mayores ventajas, son programables, las resoluciones pueden alcanzar hasta 3072 x 2320 píxeles. El principal inconveniente es que estos sistemas de fotografía no permiten capturar secuencias de vídeo con la misma velocidad que los sistemas analógicos, aunque, rara vez se precisará este tipo de capturas. Un ejemplo de cámara digital es la utilizada en nuestro laboratorio, el modelo DC280 de Leica, con resolución de 1.3 Megapixels, que permite digitalizar en 40 ms.
La iluminación es inestable en los microscopios (±10%) por lo que se recomienda conectarlo a un estabilizador de corriente.
Referencias documentales consultadas
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Autor:
Maximo Contreras.
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